YuanStem 20多能干细胞培养基

　　版本：202508V2

　　*本文中YuanStem 20，简写成YS20。

　　准备工作

　　配置YS 20完全培养基

　　1.1 将YS20 10x Supplement提前一天取出置于2℃-8℃条件下解冻。

　　1.2 用无菌移液管将50ml 10x Supplement与450mlYS20 Basal Medium混合均匀，成为YS20完全培养基(以下简称YS20完全培养基)。

　　*YS20完全培养基可在2℃-8℃避光条件下保存1月，使用前预热至室温。

　　使用Matrigel或VTN包被孔板

　　1.3a Matrigel包被孔板：按照使用品牌的说明书操作进行孔板包被，以0.1ml/cm2的用量(1ml/六孔板1孔)将Matrigel稀释液加入TC处理的培养容器中，晃动容器使其覆盖全部表面，37℃培养箱中包被一小时以上。

　　*包被好的孔板可以封口后在2-8℃保存，2周内使用。

　　1.3b VTN包被孔板：按照使用品牌的说明书操作进行孔板包被，推荐使用10ug/ml浓度进行包被，培养箱(37℃)静置至少2小时后使用。

　　使用YS20培养基复苏细胞

　　YS20复苏/传代培养基配制：室温预热YS20完全培养基，根据所用凋亡抑制剂(如Y27632等)推荐浓度加入适当体积的凋亡抑制剂，配置YS20复苏/传代培养基。

　　*Y27632推荐浓度为5-10uM。

　　吸弃包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20复苏/传代培养基，放入37℃培养箱中平衡pH和温度。

　　将细胞从液氮罐中取出，置于干冰上，转移至细胞房内。手持冻存管置于37℃水浴锅或细胞复苏仪中解冻，冻存管内仅剩小片冰晶时，用70%酒精表面消毒。

　　将冻存管内的细胞转移至含有9ml DMEM/F12或YS20完全培养基的15ml离心管中，轻轻吹打，200 g 离心 3 分钟，吸弃上清，用1-2ml YS20复苏/传代培养基重悬。

　　*使用DMEM/F12或YS20完全培养基润洗冻存管内侧以尽可能多地收集细胞。

　　以合适的密度将重悬后的细胞接种至步骤2.2准备的六孔板中，在37℃培养箱中以十字法摇晃均匀，24h后更换为YS20完全培养基。

　　*复苏时通常以50万细胞/孔或更高密度接种,正常情况下6小时内绝大部分细胞都可以完成贴壁。

　　以单细胞形态进行传代和冻存

　　* 当细胞融合度达到80-90%时，可以进行传代。

　　室温预热YS20完全培养基、PBS(不含钙、镁，下同)、TrypLE Express消化液和Matrigel/VTN包被的六孔板，并配置YS20复苏/传代培养基(步骤2.1)。

　　吸弃包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20复苏/传代培养基，放入37℃培养箱中平衡pH和温度。

　　从培养箱中取出细胞，吸弃培液。每孔加入1ml PBS，轻柔晃动孔板以润洗表面一次，吸弃。每孔加入1ml TrypLE Express，置于37℃培养箱中消化3-5分钟。

　　* 观察到细胞有明显脱壁迹象(细胞团边缘明显变亮，但其主体部分仍未脱壁)时即可进行下一步操作。

　　每孔加入1ml YS20完全培养基，用移液器轻柔吹打3-4次，将所有细胞悬液收集到含有9ml DMEM/F12或YS20完全培养基的15ml离心管中，200 g 离心 3 分钟，吸弃上清，用1-2ml YS20复苏/传代培养基重悬后计数

　　以合适的密度将重悬后的细胞接种至步骤3.2准备的六孔板中，在37℃培养箱中以十字法摇晃均匀，24h后更换为YS20完全培养基。

　　*传代扩增每个孔接种密度为10-30万细胞，其他分化实验根据需求密度接种;接种后剩余的细胞如果需要保留，可以离心去上清后以2×106/ml的密度冻存。

　　以细胞团形态进行传代和冻存

　　* 将PSC消化成细胞团形态进行传代和冻存对细胞造成的压力较小，适合不需要精确控制细胞接种数量的场景，如日常留种传代。

　　室温预热YS20完全培养基、PBS、0.5mM EDTA和Matrigel/VTN包被的六孔板

　　吸弃包被完成的六孔板中的Matrigel或VTN，每孔加入2ml YS20完全培养基，放入37℃培养箱中平衡pH和温度。

　　从培养箱中取出细胞，吸弃培液。每孔加入1ml PBS，轻柔晃动孔板以润洗表面一次，吸弃。每孔加入1ml 0.5mM EDTA消化液，置于37℃培养箱中消化5-8分钟。

　　*显微镜下观察，细胞团边缘明显变亮、有脱壁迹象时即可终止消化。

　　用移液器轻柔吹打3-4次使细胞团从六孔板表面脱落，并形成较为均匀的细胞悬液，将所有细胞悬液收集到含有9ml DMEM/F12或YS20完全培养基的15ml离心管中，200 g 离心 3 分钟，吸弃上清，用1-2ml YS20完全培养基重悬。

　　*如果细胞的贴壁力度较强，也可使用细胞刮刀辅助传代。

　　根据后续实验计划，在步骤4.2准备的六孔板中以1:5-1:20的比例接种细胞团，在37℃培养箱中以十字法摇晃均匀，24h后更换新的YS20完全培养基。

　　* 接种后剩余的细胞如需保留，可以离心去上清后以估算的100万/管的密度冻存。

　　YS20多能干细胞培养基的传代/换液方案

　　YuanStem 20多能干细胞培养基产品如下——